Gli aromi del lievito: focus sugli esteri

Come recita un noto adagio – Il birraio fa il mosto, ma è il lievito che fa la birra.
Il lievito ha un ruolo fondamentale nel definire il profilo organolettico della birra, sia per quanto riguarda la trasformazione degli zuccheri in alcol, che per la formazione di molecole aromatiche. In questo articolo ci concentreremo sul secondo aspetto, ossia sulle molecole aromatiche che vengono prodotte dal lievito e che hanno un ruolo attivo nella definizione dell’aroma della birra.

La prima domanda che ci si potrebbe porre è: come mai il lievito produce questi aromi? Sicuramente non per compiacerci.
Le molecole prodotte dal lievito sono frutto di processi metabolici, ossia reazioni chimiche/biochimiche atte a favorire in modo più o meno diretto l’esistenza della cellula di lievito stesso. Le molecole che arrivano al nostro naso sono sostanze che sono state espulse dalla cellula, elementi che per qualche motivo aveva interesse ad allontanare.
Numerosi sono i composti che hanno un ruolo aromatico (positivo o negativo), ma possono venire suddivisi in alcune principali categorie: alcoli superiori, esteri, composti solforati, acidi organici e composti carbonilici. In questo articolo ci soffermeremo sugli esteri, che assieme agli alcoli superiori sono le molecole di maggior rilevanza.

Dato l’argomento, è inevitabile addentrarsi in nozioni di chimica e biochimica, cercheremo tuttavia di rimanere il più concreti possibile.

Gli esteri sono per definizione una classe di molecole formata da un alcol (alcol etilico, il più conosciuto, ma anche propilico, iso-amilico, etc) e da un acido (acido acetico, acido butirrico, acido esanoico, etc). Nello schema sottostante sono riportate le strutture chimiche di queste molecole (ovvero alcoli e acidi presenti negli esteri maggiormente prodotti dal lievito). In rosso è evidenziato il gruppo OH (ossigeno e idrogeno legati), che caratterizza una molecola di alcol. In blu invece il gruppo COOH (carbonio, ossigeno, ossigeno e idrogeno), che caratterizza gli acidi organici. Il gruppo OH di un alcol e il gruppo COOH di un acido possono reagire tra di loro, per formare un legame COOC, ovvero un legame estereo, che caratterizza le molecole dette appunto esteri. Nello schema sottostante è rappresentata la reazione tra l’alcol e l’acido maggiormente presenti nel lievito/mosto, ovvero etanolo e acido acetico (nel lievito in realtà l’acido acetico non è presente in forma libera, ma legato ad un coenzima, il coenzima A, a formare l’acetil-coenzima A. Questa macromolecola è un importante intermedio di diverse vie metaboliche, come vedremo in seguito). Tra l’unione di questi due composti nasce l’etilacetato, che è l’estere più prodotto dal lievito. Dipendentemente dalle concentrazioni, questa molecola conferisce alla birra note fruttate o di solvente.

Altri esteri prodotti dal lievito sono il ben noto isoamil-acetato (unione tra acido acetico e alcol isoamilico, dalle note di banana/mela), l’isobutil-acetato (alcol isobutilico e acido acetico, note di banana/frutta), il 2-feniletil-acetato (alcol 2-feniletilico e acido acetico, note floreali/mela).

La reazione tra alcol ed acido non è però spontanea, ma viene resa possibile (catalizzata) da enzimi prodotti dal lievito. Inizialmente si era ipotizzato il ruolo di due enzimi diversi:

• l’enzima esterasi inversa, che catalizza la reazione tra acido e alcol tal quali, a formare l’estere;
• l’enzima alcol-acil-transferasi, che catalizza la reazione tra un alcol e un acido ma non in forma libera, bensì legato al Coenzima-A (complesso detto acil-coenzima A, abbreviato in acil-CoA).

In seguito a diversi studi e sperimentazioni, attualmente la seconda ipotesi è considerata la più attendibile.

Un piccolo inciso a riguardo: molti meccanismi che descriveremo in questo articolo sono allo stato attuale solamente ipotesi. Nonostante il lievito sia uno dei microrganismi più studiati, molti aspetti rimangono ancora ignoti, e spesso le nostre conoscenze si basano su esperimenti e conseguenti ipotesi sulle correlazioni causa-effetto, non sull’effettiva comprensione o osservazione dei meccanismi in gioco. Ciò comporta sempre la possibilità di un errore, in quanto il risultato osservato potrebbe non derivare da una delle variabili sotto controllo e oggetto di indagine, ma da una variabile non considerata. Questo causa alle volte conclusioni apparentemente in contrasto tra loro, che necessitano di ulteriori studi per essere armonizzate.

Ma torniamo alla reazione tra alcol e un acil-CoA. Dall’elenco degli esteri avrete notato che la maggior parte hanno come “parte acida” della molecola l’acetato (ossia l’acido acetico). Quindi tra i possibili acidi organici legati al CoA, quello maggiormente utilizzato nella sintesi degli esteri è l’acido acetico, legato al Coenzima A (da ora abbrevieremo per comodità in acetil-CoA; NB diverso da acil-CoA, che indica un generico acido organico legato al CoA). Questa molecola è presente in elevate concentrazioni poiché ha un ruolo centrale nei processi metabolici del lievito. Come possiamo osservare dallo schema sottostante, il lievito sintetizza principalmente l’acetil-CoA a partire dagli zuccheri (attraverso l’intermedio metabolico piruvato, che può anche intraprendere altre strade). Una volta formato, l’acetil-CoA può:

• entrare nella via metabolica detta ciclo TCA (ciclo degli acidi tricarbossilici). Tramite questo percorso il lievito otterrebbe la maggiore quantità di energia possibile dagli zuccheri. Si tratta del metabolismo aerobio, che come ben sappiamo non viene utilizzato dal lievito nelle condizioni presenti nel mosto di birra, a favore di un meno efficiente ma più competitivo metabolismo fermentativo;
• essere utilizzato dalla cellula per la sintesi di acidi grassi, che vengono principalmente utilizzati per la sintesi di lipidi con funzioni di regolazione o strutturali (ovvero steroli e acidi grassi insaturi per la stabilità della membrana, fosfolipidi, etc), o nella sintesi di triacilgliceroli (molecole di “stoccaggio energetico”);
• unirsi ad un alcol per formare un estere. La reazione viene catalizzata da un enzima specifico, la già citata alcol-acil transferasi.

Nel corso di una fermentazione, la maggior parte degli esteri prodotta deriva proprio da quest’ultima strada. Individuato il meccanismo, viene spontaneo chiedersi quindi quali siano i fattori che promuovono la formazione degli esteri. In primis vi deve essere sufficiente presenza dei reagenti necessari, ossia acetil-CoA e alcoli. Poiché gli alcoli sono presenti in abbondanza (di base l’etanolo, ma anche altri alcoli superiori la cui produzione approfondiremo in seguito), il substrato limitante è l’acetil-CoA. Questo, come abbiamo appena visto, compete per altri due possibili scopi metabolici (formazione energia tramite TCA e formazione acidi grassi), mentre gli esteri sono perlopiù un “sottoprodotto”, che viene espulso dalla cellula. È ragionevole quindi pensare che l’acetil-CoA, quando possibile, venga destinato dal lievito a una delle prime due strade, e venga esterificato ed espulso solamente quando non vi siano alternative. Questo ha spinto alcuni ricercatori ad ipotizzare che la formazione di esteri abbia precisamente lo scopo di regolare la concentrazione intra-cellulare di acetil-CoA e CoA, ovvero: il lievito produce esteri acetici nel momento in cui vi è un’abbondanza di acetil-CoA e non è possibile il suo utilizzo tramite il ciclo TCA o la biosintesi di acidi grassi insaturi o steroli.

Durante una normale fermentazione, il ciclo TCA (che fa parte del metabolismo aerobio) non viene praticamente utilizzato dal lievito.
Per quanto riguarda la biosintesi di acidi grassi insaturi o steroli, questa viene utilizzata dal lievito per produrre molecole che hanno diversi ruoli metabolici, tra i quali quello di garantire l’integrità della membrana in termini di fluidità e corretta permeabilità. La produzione di tali molecole necessita di ossigeno, quindi durante la fermentazione, esaurito l’ossigeno disciolto nel mosto, il lievito si ritrova in una condizione nella quale non può più destinare l’acetil-CoA nemmeno a tale scopo (potrebbe usarlo per produrre acidi grassi saturi, ma come vedremo non si tratta di molecole che il lievito ha grande interesse a sintetizzare, anzi tende ad espellere).
A questo punto, per evitare l’accumulo di acetil-CoA, e al contempo rendere nuovamente disponibile il Coenzima A (che ha anche altre funzioni metaboliche), tramite l’azione delle alcol-acil-transferasi la cellula sintetizza un estere acetico, e ripristina il Coenzima A libero. Gli esteri così formati, essendo molecole piccole e lipofile, riescono ad attraversare la membrana ed uscire dalla cellula.

La regolazione di questo meccanismo tuttavia non dipende solamente dalla quantità di acetil-CoA libero, ma anche dalla presenza degli enzimi alcol-acil-transferasi (che d’ora in poi chiameremo AAT). Da alcuni esperimenti su cellule modificate geneticamente (affinché producessero quantità molto elevate di questi enzimi), si è osservato come in realtà il fattore limitante della produzione degli esteri non sia la quantità di acetil-CoA, ma proprio la concentrazione di questi enzimi. Le cellule di lievito modificato avevano infatti prodotto quantità molto più elevate di esteri, nonostante le concentrazioni di acetil-CoA disponibile fossero le medesime.
Da questo deduciamo che la quantità di esteri acetici prodotta dipende sì dalla disponibilità di acetil-CoA, ma soprattutto dalla presenza degli enzimi alcol-acil-transferasi. La presenza di questi ultimi deriva a sua volta principalmente da due fattori:
1 – dal ceppo di lievito e dalla sua propensione genetica alla produzione di tali enzimi;
2 – da fattori esterni che possono stimolare o reprimere l’espressione dei geni responsabili della sintesi di tali enzimi (NdA: un lievito infatti può possedere nel suo DNA le informazioni per la sintesi di un certo enzima, ma non è detto che questa informazione – detta gene – venga utilizzata, bensì potrebbe rimanere “latente”).
Ad esempio, è stato osservato che la presenza di acidi grassi insaturi o di ossigeno inibisce la sintesi delle AAT.

Cerchiamo ora di riassumere schematicamente quanto detto finora:
– la quantità di esteri acetici prodotta dal lievito dipende dalla concentrazione di acetil-CoA e di enzimi AAT;
– nelle condizioni di fermentazione, la quantità di acetil-CoA disponibile per la formazione degli esteri è inversamente proporzionale alla quantità utilizzata per la biosintesi di acidi grassi/steroli. La biosintesi di acidi grassi è a sua volta correlata alla moltiplicazione cellulare (il lievito man mano che si replica e divide le cellule, cerca di mantenere la corretta fluidità di membrana anche delle cellule figlie). Ciò che inizialmente stimola la crescita cellulare, va ad aumentare il pool di acetil-CoA, che poi però non può essere dedicato alla sintesi di acidi grassi insaturi/steroli se la cellula si ritrova in mancanza di ossigeno;
– la quantità (e la tipologia) di enzimi AAT presenti dipende dal ceppo di lievito, e dall’espressione di specifici geni che viene influenzata anche da condizioni ambientali come presenza nel mosto di acidi grassi insaturi, ossigeno, e rapporto e tipologia di zuccheri e azoto assimilabile.

Quindi, come empiricamente era già noto, abbiamo diversi modi per influenzare la capacità di produrre esteri del lievito:

1. scegliere un lievito che di base si presenti neutro, avendo una bassa espressione dei geni per la sintesi delle AAT;
2. evitare la formazione di un “disavanzo” di acetil-CoA, quindi o inibendo fin dall’inoculo la crescita cellulare (utilizzando un inoculo consistente, fermentando in pressione o fermentando a basse temperature); oppure garantendo che una moltiplicazione cellulare elevata sia accompagnata da un adeguato apporto di ossigeno (quest’ultimo ha anche l’effetto diretto di repressione della sintesi di AAT);
3. reprimere, quanto possibile, la sintesi degli enzimi AAT (apportando una corretta quantità di ossigeno, o integrando il mosto con appropriate quantità di acidi grassi insaturi, o variando le quantità e tipologie di carboidrati e azoto assimilabili del mosto).

Ovviamente, nel caso volessimo invece promuovere la produzione di esteri, andremmo ad agire nella direzione opposta.

Vi sono anche altri meccanismi che concorrono alla quantità di esteri rilasciati. Ad esempio, in determinate condizioni la temperatura influisce positivamente sulla quantità di esteri prodotti, non solo in quanto stimola la crescita, ma anche perché aumenta la permeabilità della membrana. Anche la quantità e tipologia di alcoli superiori prodotti (come “scarto” della sintesi degli amminoacidi) ovviamente influenza la tipologia di esteri presenti (essendo questi l’altro mattoncino che compone una molecola di estere).
Inoltre, in tutto questo non abbiamo approfondito ancora il meccanismo di origine degli esteri non acetici, ma formati da etanolo e acidi grassi a corta catena. Questi hanno origine leggermente diversa rispetto agli esteri acetici, anche se in linea di massima la loro produzione può essere regolata similmente. Ma approfondiremo maggiormente in un articolo dedicato.

A conclusione di questo lungo excursus, riporto un’altra interessante teoria che riguarda lo scopo degli esteri.
In natura, molti lieviti sono presenti sulle bucce dei frutti. Quando, per un’ammaccatura o per l’azione di insetti/volatili, la buccia del frutto si rompe ed il succo zuccherino viene a contatto con i lieviti, si ha l’inizio di piccole fermentazioni localizzate (NdA: il lievito fermenta anche in presenza di ossigeno, se le concentrazioni zuccherine sono superiori a 50 g/L – effetto Crabtree. Si ipotizza sia un meccanismo per vincere la competizione con altri microrganismi, in quanto l’alcol così prodotto rappresenterebbe un metabolita tossico per i “competitor”, mentre il lievito riesce a sopportarne basse concentrazioni). Durante queste fermentazioni, alcuni ricercatori hanno riscontrato che gli esteri prodotti dai lieviti comportano una maggiore attrattività di tale frutta nei confronti di diverse tipologie di insetti. Favorendo l’avvento di insetti, il lievito aumenterebbe le possibilità di essere trasportato lontano dal suo luogo d’origine, aumentando la diffusione geografica della specie, che è un fattore positivo da un punto di vista evoluzionistico. Nulla esclude quindi che la formazione di esteri abbia molteplici effetti positivi per il lievito, sia come eliminazione di metaboliti di scarto/rigenerazione di metaboliti utili, che come fattore positivo per la diffusione della specie.
Tra tutte queste ipotesi, di certo vi è che gli esteri fanno piacere a noi, consumatori di birra, e sono una delle cause della nostra lunga e proficua collaborazione con il lievito!

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